2.鉴别方法 2．1性状鉴别五味子呈不规则的球形或扁球形,直径5～8mm表面红色紫红色或暗红色,皱缩,凹凸不平,显油润:有的表面呈黑红色或出现“白霜”。果肉柔软,种子1～2枚,肾形,长4～5mm,表面棕**,平滑有光泽;种皮薄而脆,种脐在一侧,显著凹入,颜色较深;除去种皮可见淡**胚乳,角质状,油性,胚小,位于一端。种子破碎后,有香气,味酸而辛烈,微苦。南五味子呈球形或扁球形,直径4～6mm,表面棕红色至暗棕色,干瘪,皱缩。果肉常紧贴在种子上,有时微有白色粉霜。内含种子1～2枚,肾状球形,直径3～4 mm,表面黄棕色,微粗糙,有光泽,种皮薄而脆;种脐在一侧,稍凹入,脊部粗糙,具有疣状突起;胚乳富含油性,胚小,位于一端。果肉气微,昧微酸。两者的主要鉴别要点是:五味子表面显红色、紫红色,皱缩,油润,果肉柔软;南五味子,表面棕红色至暗棕色,皱缩干瘪,果肉紧贴种子上。 2．2显微鉴别 五味子粉末呈暗紫色,种皮表皮石细胞表面观呈多角形或长多角形,壁厚,孔沟极细密,细胞腔内含深棕色物;种皮内层石细胞呈多角形,类圆形或不规则,壁稍厚,纹孔较大。果皮表皮细胞表面观类多角形,垂周壁呈连珠状增厚,表面有角质线纹,表皮中散有油细胞;中果皮细胞皱缩,内含深棕色物及淀粉粒,淀粉粒类圆形或多角形,单粒圆球型,复粒由2-6个分粒组成,可见脐点。南五味子粉末呈暗棕色。种皮表皮石细胞表面观呈多角形或长多角形,壁厚,孔沟极密,细胞腔内含棕色物;种皮表皮石细胞纵断面呈长方形,外侧壁无突起,较内壁厚,壁孔及孔沟细小或不明显。种皮内层石细胞呈长圆形或类圆形,壁厚,壁孔及孔沟明显。果皮表皮细胞表面观类多角形,垂周壁不呈连珠状增厚。淀粉粒单粒呈不规则的圆形,复粒由2-4个分粒组成。两者的主要鉴别要点是:五味子果皮表皮细胞类多角形,垂周壁略呈连珠状增厚,而南五味子果皮表皮细胞表面观类多角形,垂周壁不呈连珠状增厚。 2．3色谱鉴别 2．3．1薄层色谱法(TLC) 薄层色谱法是中药鉴别中专属性较强的一种方法,应用较普遍。韩正洲等采用高效硅胶GF254板,以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-甲酸(15:5:1)上层溶液加石油醚(60～90℃)为展开剂展开,以五味子甲素、乙素为对照品,在紫外灯254nm下观察荧光淬灭点,结果南五味子薄层图谱中无五味子乙素斑点。 2．3．2高效液相法(HPLC) 冷文金等以五味子对照药材为对照品，采用AllitimaC18(4.6mm×250mm)柱,以甲醇-水(13:7)为流动相,检测波长为250nm,以保留时间为鉴别参数,结果五味子对照药材共9个峰,样品五味子共8个峰,与对照药材相比少1个峰,其它峰保留时间都与对照药材一致; www.xiangshui88.com 南五味子共6个峰,且只有1个峰与对照药材一致,由此可以鉴别两者。陈洪轩等建立了五味子指纹图谱,色谱柱:ODS柱(4.6mm×250mm),检测波长:254nm,柱温:30℃,流速:1 mL·min-1,流动相:甲醇-水梯度洗脱,分别以五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲作为对照品检测,结果南五味子图谱与北五味子的HPLC指纹图谱有较大差别,以五味子甲素为参照,有3个共有峰。 2．4光谱法鉴别 2．4．1紫外分光光度法 邓君丽等取南、北五味子水提取液,在200～400nm波长范围内进行扫描,结果南五味子在282nm处有最大吸收,在274nm处有最小吸收;北五味子在283nm处有最大吸收,在248nm处有最小吸收,以此作为鉴别依据。程秀民等取南、北五味子,分别用极性溶剂和非极性溶剂提取,测定其紫外零阶、二阶导数光谱,结果极性溶剂提取物光谱有鉴别意义。北五味子在272±6nm出现一个大宽峰,南五味子在272nm处只出现两个小肩峰;对二阶导数光谱进行分析,发现两者的光谱形状及光谱数据均有明显差异。 2．4．2荧光光谱法程秀民等对南、北五味子的极性溶剂和非极性溶剂提取物,分别测定荧光光谱,结果北五味子和南五味子的极性溶剂提取物光谱,北五味子激发光谱出现三个峰和三个小肩峰,最大激发波长为257nm,最大发射波长为352nm;南五味子激发光谱出现一个峰和三个肩峰,最大激发波长为210nm,最大发射波长为347nm。二者的激发光谱有较大差异,有鉴别意义。发射光谱差异较小,不具备鉴别意义。非极性溶剂提取物光谱,北五味子激发光谱出现一个峰和一个小肩峰,最大激发波长为341nm;南五味子激发光谱出现两个峰,最大发射波长为319nm,区别较明显。 2．4．3红外光谱法 田进国等取药材分别用石油醚、乙醚和水提取,提取物经溴化钾压片，扫描测定红外光谱。结果北五味子的光谱与对照药材在峰的数目、峰位和www.flm8.com 峰形都能吻合,仅某些峰的相对强弱有差异。南五味子的光谱轮廊与北五味子的非常相似,这说明其成分大体相似,但是除了某些峰的相对强度有变化外,还出现了几个新的吸收峰。这些光谱特征可以作为区别南、北五味子的依据。 2．5生物鉴别 2．5．1简单重复顺序列间多态性(Inter-simple Se-quence Repeat,ISSR)技术ISSR技术是根据真核生物基因组中广泛存在着以1～6个碱基的短核苷酸序列为基本单位的重复序列的现象,以PCR为基础,采用20个碱基左右的重复锚定引物扩增基因组中这些重复序列之间的片段，具有稳定性好、多态性高的优点,已被广泛应用于中药品种鉴定。孙岳等采用CTAB法,从去除果肉果皮的五味子果实中提取总DNA,并用ISSR技术对南、北五味子基因组DNA进行PCR扩增,结果9个ISSR引物中有3个扩增出多态性好的条带,根据其琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA带型差异可迅速区分南、北五味子。 2．5．2随机扩增多态DNA(Random Amplified Poly-morphic DNA，RAPD)技术RAPD技术,是一种用于检测基因组DNA多态性和基因组遗传标记的方法。王培训等采用改良高盐低pH法提取DNA,并用随机扩增引物DNA法,筛选适于鉴别南、北五味子的随机引物,结果得到一条引物S429能准确区分南、北五味子,可利用随机引物S429通过RAPD准确区分南、北五味子。
