灵芝多糖(灵芝多糖含量测定的方法)

灵芝粗多糖是灵芝孢子最主要的有效成分。以粗多糖的检测方法为例进行说明。 灵芝粗多糖的检测方法如下：

1）试剂：

浓硫酸；无水乙醇；5％苯酚溶液；80％乙醇溶液

2）样品处理

取样品2.0g于200ml容量瓶中，加入约150ml水，沸水浴提取40min，取出，放冷，用水定容，摇匀后过滤，取滤液10ml，加入40ml无水乙醇，3000转/分离心5min，弃去上清液，残渣用80％乙醇洗涤，离心（重复此过程2次），用水溶解残渣，定容为20ml。此液即为样品处理液。

3）标准曲线

取0.2mg/ml葡萄糖标准溶液0.0, 0.10, 0.20, 0.30, 0.40, 0.50ml，用水定容为1.0ml，加入0.5ml苯酚溶液，10ml浓硫酸，混匀，放置至室温，于L= 1ml，波长＝485nm测定吸收光度，绘制标准曲线。

4）样品测定

取样品处理液0.5ml于具塞比色杯中，以下同标准曲线操作。测定吸光度。

5）计算

C×200×20/10/0.5

X (mg/g) = ————————

M x 1000

式中：X：为样品粗多糖含量(mg/g)

C：为从标准曲线上查出的含量（μg）

M：为取样量（g）

灵芝菌丝体多糖的提取

（一）材料

⒈菌种：湖南省食用菌研究所提供的韩国灵芝母种。

⒉种子培养基：玉米粉2% 大米粉2%

蔗糖2% 磷酸二氢钾o.1g

硫酸镁0.05% ph值自然

⒊发酵培养基：麦麸浸出液10% 葡萄糖2%

硫酸铵0.2%

磷酸二氢钾0.2% ph值自然

（二）方法 1.种子培养：

⒉发酵培养生产菌丝体。

⒊测定干、湿菌丝体。

将发酵液进行离心，然后取其沉淀物，加人60%蔗糖，进行高速（3000转/分）密度梯度离心5分钟，取上层菌丝体，洗净蔗糖再压干，即得湿菌体，然后再将湿菌体于高温下烘干即为干菌体。分别称取其重量。

⒋多糖的提取。

菌丝体预处理。取适量的灵芝湿菌体，用乙醇等有机溶剂进行处理，以除去湿菌体中的脂类物质，同时使糖苷酶失去活性，防止多糖的降解。

⑵用热水提取多糖。取上面经预处理的灵芝湿菌体，放人1：20的热水（95℃）中浸提，一次3小时，连续浸提3次，合并3次的水浸提液减压、浓缩至一定体积，再用3倍体积的95%乙醇混合，静置10－12小时，再离心，最后加入75%的乙醇反复洗涤，以沉淀多糖。此沉淀物为粗多糖，其中混杂有蛋白质、色素、低聚糖等小分子杂质，一般要经过纯化。

⑶多糖的纯化，去蛋白质和deae纤维素柱层析。去蛋白质一般采用sevag法：加入0.2倍多糖溶液体积的氯仿和0.04倍体积的正丁醇混合振荡半小时进行分离，直至氯仿与水的界面无沉淀为止，且要重复处理2-3次才能有效除去多糖中的蛋白质。多糖纯化一般采用硼酸型deae纤维素柱层析法：取脱蛋白后的多糖，分别以0.025mol/l、0.1mol/l的硼砂，0.1mol/l的氢氧化钠溶液进行洗脱，然后用0.2%恿铜硫酸液比色测定吸收度，收集有多糖的洗脱液，再浓缩脱盐即得所需的多糖。

⑷多糖纯度的鉴定。

可用电泳法进行鉴定，如果存在单一带，说明为纯多糖。

⒌多糖与多糖中蛋白质含量的测定：

取一定量菌丝体粗多糖，加水煮沸溶解，用sevag方法脱去蛋白考马斯亮兰法测其粗多糖中蛋白质和多糖的含量。测得菌丝体中粗多糖含17.01%、多糖含5.43%、蛋白质含量2.16%。

灵芝子实体多糖的提取

（一）材料 1.菌种：韩国灵芝栽培种。

⒉子实体栽培生产料：木屑78%，米糠20%，蔗糖1%，

石膏1%，ph值自然。

（二）方法

⒈子实体栽培。

⒉灵芝子实体预处理。

⒊子实体多糖的提取。

取适量的灵芝子实体，捣碎成粉末，用80目筛过筛，然后用热水提取法进行提取。具体操作同菌丝体多糖的提取。提取出的粗多糖含有色素、蛋白质等小分子杂质，也须除去。

⒋去除蛋白质和色素。

子实体粗多糖去除蛋白质也采用se阴法。去除色素，目前尚未发现很理想的方法。一般用乙醇进行反复冲洗，但效果不很理想。

⒌多糖纯度的鉴定。

同菌丝体多糖纯度的鉴定。

⒍子实体粗多糖、多糖及蛋白质含量的测定。

具体方法同菌丝体多糖及蛋白质含量的测定。测得子实体中粗多糖7.5%、多糖1.5%，蛋白质0.6%，其含量均低于菌丝体中的含量。可见菌丝体阶段就形成了灵芝多糖的有效成分，为灵芝液体深层发酵生产菌丝体提供了科学依据。